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Terapia Génica en el tratamiento del Sí­ndrome de Usher
jueves, 28 de junio de 2007

Concepción Lillo Delgado, de la Universidad de Salamanca Y Andrés Mayor Lorenzo, de la Asociación Asturiana de Retinosis Pigmentaria en la charla: Terapia Génica en el tratamiento del Sí­ndrome de Usher.

Dra. Concepción Lillo Delgado. Universidad de Salamanca. España.

El sí­ndrome de Usher es una enfermedad autosómica recesiva que afecta en gran medida a dos de los órganos de los sentidos más importantes para la comunicación del ser humano, como son el oí­do y la vista, y por lo tanto, comporta una grave disminución fí­sica de la persona que lo sufre. Existen tres tipos de sí­ndrome de Usher, dependiendo de la gravedad de la enfermedad, denominándose de más a menos grave USH1, USH2 y USH3 respectivamente. Las personas con USH1 nacen sordas y van perdiendo visión a partir de la pubertad al desarrollar retinosis pigmentaria.

En el caso de las personas que presentan USH1, éstas pueden presentar mutaciones en genes de diferente origen. Así­, el subtipo USH1B afecta a personas con mutaciones en el gen para miosina 7a. Este subtipo es uno de los más severos en cuanto a las deficiencias fí­sicas, y además es el que afecta a mayor número de personas en el mundo. La proteí­na mutada en este subtipo, la miosina 7a está presente en varias partes del organismo, pero parece ser que juega un papel crí­tico en el desarrollo del oí­do y en el correcto funcionamiento de la retina. En la retina de vertebrados, incluido los humanos, la proteí­na miosina 7a está presente en niveles elevados en el epitelio pigmentario de la retina (EPR), donde la mayorí­a se asocia a los melanosomas presentes en este tipo celular1,2. Además, esta proteí­na también se encuentra en menor proporción en las células fotorreceptoras3.

La terapia génica consiste en el reemplazamiento del gen mutado por una copia del gen sano. Este tipo de terapia puede ser de gran utilidad en el caso de enfermedades causadas por mutaciones en genes conocidos. Para el uso de este tipo de terapia es necesario que existan al menos dos requisitos indispensables: conocer la secuencia exacta del gen sano, conocer la localización celular y la función exacta de la proteí­na producto de este gen. El gen y la proteí­na mutada causantes de la enfermedad de Usher 1B cumple estos dos requisitos, por lo que parece ser un buen candidato para este tipo de tratamiento con terapia génica.

En trabajos recientes, se ha demostrado que esta técnica ha dado buenos resultados tras haber podido reemplazar genes defectuosos implicados en casos de degeneración retiniana en animales de laboratorio. Así­, por ejemplo, en el tratamiento de perros y ratones mutantes para RPE65 con adenovirus conteniendo el gen sano que codifica para dicha proteí­na, que resulta esencial para el correcto funcionamiento del ciclo visual y sin la cual la retina acaba degenerando, se ha conseguido preservar la estructura de la retina y su funcionamiento fisiológico a corto y largo plazo4,5. Por tanto, tras experimentos previos con éxito en otros mutantes, nos propusimos sustituir el gen de la miosina 7a en un ratón con una mutación en dicho gen, por el gen completo humano sano. Este ratón se denomina Shaker1 4626SB, es sordo, y como veremos más adelante, posee ciertas disfunciones retinianas, aunque su retina no degenera.

Para poder insertar el gen de interés en la retina del ratón mutante, utilizamos un tipo de virus, el lentivirus, que posee unas propiedades de empaquetamiento de información génica y de infección muy importantes para nuestro experimento.

La terapia génica en Usher 1B presenta un reto importante debido al gran tamaño del gen para miosina 7a, que es de unas 100Mb. Entre los diferentes tipos de virus existentes utilizados en terapia génica, parece ser que el que puede acomodar transgenes de gran tamaño son los lentivirus de tercera generación. Para hacernos una idea, la capacidad de empaquetamiento de los adenovirus es de 5.2kb. Para que la información génica sea capaz de integrarse en las células de interés, en este caso las células del epitelio pigmentario y los fotorreceptores, es necesario que además del gen sano, se incluya en la construcción de este virus, un promotor especí­fico para el tejido de interés. En nuestro caso se utilizó un promotor quimérico, es decir, una mezcla de promotores, que contení­a un promotor parcial del citomegalovirus que se fusionó a 160 pares de bases de la secuencia de miosina 7a humana.

Antes de infectar los ojos de los ratones mutantes con este virus conteniendo la información de interés, nos propusimos tratar células del epitelio pigmentario de ratón en cultivo con el lentivirus para así­ comprobar su eficacia de infección e integración del gen de interés dentro del ADN celular. La infección de los cultivos de epitelio pigmentario dio como resultado un 95% de eficacia en la infección, y los niveles de expresión de la proteí­na y su localización en las células eran muy similares a los niveles de las células de un epitelio pigmentario control. Estos resultados fueron confirmados tanto por métodos bioquí­micos como inmunohistoquí­micos.

Tras estos ensayos in vitro, pasamos a la parte experimental en animales mutantes para miosina 7a, Shaker1, a los que inyectamos los lentivirus conteniendo el gen sano en el espacio subretinal, entre la retina y el epitelio pigmentario. Utilizamos animales de diferentes edades para realizar las inyecciones, y más tarde fueron analizados a diferentes tiempos tras la inyección. Los que dieron mejor resultado fueron aquellos que inyectamos a P0 (recién nacidos), ya que eran los que presentaban mayor número de células infectadas expresando la proteí­na sana. La técnica inmunohistoquí­mica en cortes de retinas inyectadas demostró que el 30-50% de las células del epitelio pigmentario eran positivas para miosina 7a, y que la mayorí­a de las células que no expresaban esta proteí­na estaban localizadas lejos de la zona donde se realizó la inyección. También comprobamos que el nivel de expresión de la proteí­na sana era variable de unas células a otras. Este nivel condicionaba el que la proteí­na funcionara correctamente o no, ya que aquellas células que presentaban niveles de expresión inferior al nivel de una célula control, no presentaban melanosomas en las microvellosidades.

Además de comprobar que estas células expresaban la proteí­na de interés, estábamos interesados en conocer si la proteí­na sana era capaz de realizar su función en las células que previamente eran mutantes. El ratón Shaker1 carece completamente de miosina 7a en todas sus células, y una consecuencia de ello es que la porción apical de las células del epitelio pigmentario, donde se encuentran sus microvellosidades, está completamente desprovista de melanosomas, mientras que en un ratón control, estos orgánulos se distribuyen normalmente en esta zona de la célula. En los ratones mutantes inyectados con el lentivirus conteniendo el gen sano comprobamos que en la mayorí­a de las células del epitelio pigmentario positivas para miosina 7a que presentaban niveles de expresión de la proteí­na similares a los de una retina control, los melanosomas volví­an a estar presentes en las microvellosidades (Figura 1).

Otra de las diferencias de los ratones Shaker1 respecto a los ratones control es que debido a la falta de miosina 7a en los fotorreceptores, se produce una acumulación de moléculas de opina en el cilio conector de estas células. Estas moléculas, en una retina normal pasan del segmento interno del fotorreceptor, donde son sintetizadas, al segmento externo, donde realizan su función, y esto lo hacen a través del cilio que conecta estos dos segmentos. La acumulación anormal de estas moléculas en el cilio conector indica que miosina 7a podrí­a estar implicada en algún proceso de su desplazamiento entre estos compartimentos. Tras el tratamiento con el lentivirus, comprobamos que este defecto fue también corregido en muchos de los fotorreceptores cercanos a la zona donde se realizó la inyección (Figura 2).

Conclusiones

  1. Se puede reemplazar un gen defectuoso por otro sano mediante terapia génica con el uso de lentivirus, y que su proteí­na sana es capaz de funcionar correctamente en las células en las que antes no lo hací­a.
  2. Se demuestra la importancia de que en las células de interés el nivel de expresión de miosina 7A sea el correcto, ya que este factor es crí­tico para lograr restaurar la funcionalidad de la proteí­na.

Por tanto parece ser que nuestros resultados abren la posibilidad de utilizar los lentivirus como un vehí­culo efectivo para la transmisión y expresión de genes de interés para el tratamiento de otras distrofias retinianas causadas por la pérdida de la función de genes de gran tamaño.

Bibliografí­a

  1. Hasson T, Heintzelman MB, Santos-Sacchi J, Corey DP, Mooseker MS. Expression in cochlea and retina of myosin VIIa, the gene product defective in Usher syndrome type 1B. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 9815”“9819.
  2. Gibbs D, Azarian SM, Lillo C, Kitamoto J, Klomp AE, Steel KP, Libby RT, Williams DS. Role of myosin VIIa and Rab27a in the motility and localization of RPE melanosomes. J Cell Sci 2004; 117: 6473”“6483.
  3. Liu X, Vansant G, Udovichenko IP, Wolfrum U, Williams DS. Myosin VIIa, the product of the Usher 1B syndrome gene, is concentrated in the connecting cilia of photoreceptor cells. Cell Motil Cytoskel 1997; 37: 240”“252.
  4. Pang JJ, Chang B, Kumar A, Nusinowitz S, Noorwez SM, Li J, Rani A, Foster TC, Chiodo VA, Doyle T, Li H, Malhotra R, Teusner JT, McDowell JH, Min SH, Li Q, Kaushal S, Hauswirth WW. Gene therapy restores vision-dependent behavior as well as retinal structure and function in a mouse model of RPE65 Leber congenital amaurosis. Mol Ther 2006; 13: 565”“572.
  5. Acland GM, Aguirre GD, Bennett J, Aleman TS, Cideciyan AV, Bennicelli J, Dejneka NS, Pearce-Kelling SE, Maguire AM, Palczewski K, Hauswirth WW, Jacobson SG. Long-term restoration of rod and cone vision by single dose rAAV-mediated gene transfer to the retina in a canine model of childhood blindness. Mol Ther 2005; 12: 1072”“1082.

4 Comentarios sobre “Terapia Génica en el tratamiento del Sí­ndrome de Usher”

  1. LUIS dice:

    Mi consulta es si la terapia genica se ha realizado en humanos y con que resultados. Mi hija pade el sindrome de uscher II.
    Cuales son las perpespectivas de este tratamiento para el futuro.
    Eduardo Morneo

  2. Vladimir dice:

    Yo padesco retinosis pigmentaria y me gustaria saber si su tratamiento es factible para mi padecimiento.

  3. matias dice:

    alguien responde en este lugar o solo preguntan?

  4. PEDRO dice:

    TENGO UN HIJO QUE ESA PERDIENDO SU CAMPO VISUAL, TIENE 22 ANOS, SE PUEDE DAR ALGUN TRATAMIENTO O ALGO PARA EVITAR SU CEGUERA?

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